Летучие мыши ведут ночной образ жизни, а днем спят, повиснув вниз головой.
Гнезд летучие мыши не вьют. Летучие мыши способны впадать в оцепенение, сопровождающееся уменьшением скорости обмена веществ, интенсивности дыхания и частоты сердечных сокращений, многие способны впадать в длительную сезонную спячку.
Большая часть питается насекомыми, однако большие летучие мыши (например, гигантская вечерница) могут питаться птицами, ящерицами, лягушками, рыбой.
Для ориентации в пространстве используют эхолокацию, летучая мышь действует как радар. Носом или ртом она издает неслышные для человека звуки в ультразвуковом диапазоне частот, которые, отражаясь от предметов, возвращаются словно эхо.
Улавливая такие сигналы, летучая мышь ориентируется в пространстве и определяет размеры, местонахождение и плотность окружающих ее предметов.